線粒體膜電位熒光探針是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電△Ψm位的理想熒光探針。染料以電勢(shì)依賴性的方式積聚在線粒體內(nèi)，可以用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。正常線粒體內(nèi)，聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光(Ex=585 nm, Em=590 nm)；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，只能以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光(Ex=514 nm, Em=529 nm)。不僅可用于定性檢測(cè)，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測(cè)，因線粒體的去極化程度可以通過(guò)紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來(lái)衡量。觀察時(shí)，只需使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。
 

　　線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過(guò)線粒體膜電位熒光探針從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用它從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。
 

　　線粒體膜電位熒光探針使用方法：
 

　　1. 工作液配制：
 

　　1)粉末(5 mg)：直接加1 mL DMSO到粉末內(nèi)，室溫顛倒混勻使其充分溶解，即得到5 mg/mL的儲(chǔ)存液。溶液分裝成小量?jī)?chǔ)存于-20℃，避光干燥，避免反復(fù)凍融。
 

　　2)儲(chǔ)存液(1 mg in DMSO)：本品是JC-1的DMSO儲(chǔ)存液，濃度為5 mg/mL。使用者需要根據(jù)單次用量來(lái)分裝，-20℃避光干燥，避免反復(fù)凍融。
 

　　3)工作液配制：將凍存的儲(chǔ)存液置于室溫充分融化，之后用緩沖液或者預(yù)熱的培養(yǎng)基直接稀釋儲(chǔ)存液(5 mg/mL)到需要的工作液濃度，邊震蕩邊稀釋，充分混勻。為了去除任何不溶顆粒，建議13,000 x g離心JC-1工作液1 min，小心吸取上清轉(zhuǎn)移到新的管子內(nèi)。整個(gè)過(guò)程要避光操作。注意：因JC-1不溶于水，很可能在稀釋到工作液的過(guò)程中形成聚集顆粒，則建議細(xì)胞染色前用離心或者過(guò)濾的方法去除這些顆粒后再使用。
 

　　2. 染色步驟(流式細(xì)胞儀)
 

　　1)于6-，12或24-孔板上進(jìn)行細(xì)胞鋪板，密度為5×105 cells/mL。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。選擇合適的化合物根據(jù)特定的步驟進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)。 注：進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度建議不超過(guò)1×106 cells/mL，也可根據(jù)自己的細(xì)胞類型培養(yǎng)至合適的密度。
 

　　2)取0.5 mL細(xì)胞懸液至無(wú)菌的離心管內(nèi)；
 

　　3)室溫條件400 x g離心5 min；吸掉上清。
 

　　4)用0.5 mL JC-1工作液重懸細(xì)胞，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育15-30 min；注意：一般情況，15 min足以進(jìn)行充分的染色。
 

　　5)室溫條件400 x g離心5 min；吸掉上清；
 

　　6)用2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液或者緩沖液重懸細(xì)胞，之后室溫條件400 x g離心5 min；吸掉上清；
 

　　7)重復(fù)步驟6)；
 

　　8)用0.5 mL新鮮培養(yǎng)液或者緩沖液重懸細(xì)胞，即可進(jìn)行后續(xù)的流式分析。注意：請(qǐng)馬上進(jìn)行流式定量分析，此細(xì)節(jié)很重要。
 

　　數(shù)據(jù)分析：含有紅色JC-1聚集物的健康細(xì)胞線粒體用FL2通道檢測(cè)；含有綠色JC-1單體的凋亡或不健康細(xì)胞用FL1(FITC)通道檢測(cè)。
 

　　3. 染色步驟(熒光顯微鏡)
 

　　A.懸浮細(xì)胞
 

　　1)-6)同上JC-1染色步驟(流式細(xì)胞儀)；
 

　　7)用0.3 mL的緩沖液重懸細(xì)胞，即可進(jìn)行熒光顯微鏡檢測(cè)。注意：請(qǐng)馬上進(jìn)行熒光顯微分析，此細(xì)節(jié)重要。
 

　　B.貼壁細(xì)胞
 

　　1)培養(yǎng)皿內(nèi)用蓋玻片進(jìn)行細(xì)胞爬片或者細(xì)胞培養(yǎng)在腔室玻片(chamber slide)上。選擇合適的化合物根據(jù)特定的步驟進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)。
 

　　2)染色前開(kāi)始配制工作液，配制步驟見(jiàn)上。
 

　　3)吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入足夠覆蓋所有細(xì)胞的工作液。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育15-30 min；注意：一般情況，15 min足以進(jìn)行充分的染色。
 

　　4)吸掉培養(yǎng)液，然后用合適的緩沖液來(lái)清洗細(xì)胞2次。
 

　　5)加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(培養(yǎng)液可含有血清和酚紅)或者PBS緩沖液，于熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察。數(shù)據(jù)分析同A. 懸浮細(xì)胞。
 

　　注意事項(xiàng)：
 

　　1)線粒體膜電位熒光探針是光敏感性的，所有染色步驟的操作過(guò)程中避免強(qiáng)光接觸。
 

　　2)染色完成后，立即進(jìn)行后續(xù)的結(jié)果分析非常必要；
 

　　3)為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
 

　　4)本產(chǎn)品僅供科研使用。請(qǐng)勿用于醫(yī)藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請(qǐng)勿存放于普通住宅區(qū)。